Убиквитин и регуляция апоптоза опухолевых клеток линии Jurkat

Abstract

Актуальность. Одной из актуальных задач медицины является изучение молекулярных механизмов селективного управления апоптотической гибелью опухолевых клеток в результате конформационных изменений белковых молекул (убиквитинилирования). Цель исследования: установить роль убиквитина и убиквитинлигазы в дексаметазон-индуцированном апоптозе опухолевых клеток линии Jurkat. Материалы и методы. Интактные и культивированные при дополнительном добавлении индуктора апоптоза дексаметазона в конечной концентрации 10мкМ опухолевые клетки линии Jurkat. Методом проточной цитофлуориметрии в интактных опухолевых клетках линии Jurkat и после предварительного воздействия дексаметазоном проводили оценку реализации апоптоза с использованием FITС-меченного аннексина V и пропидия иодида, количества FASи TNF-рецептор 1 положительных клеток со сниженным митохондриальным потенциалом. Методом вестерн-блоттинга определяли содержание транскрипционных факторов NF-κB, Apaf-1; убиквитина и убиквитинлигазы; активность каспазы-3 регистрировали спектрофлуориметрическим методом. Результаты. При добавлении дексаметазона – индуктора апоптоза – в среду культивирования опухолевых клеток линии Jurkat установлено снижение концентрации убиквитина и возрастание содержания убиквитинлигазы на фоне активации рецепторного (увеличение доли аннексин-, FASи TNFрецептор 1 положительных клеток) и митохондриального (возрастание числа клеток со сниженным митохондриальным потенциалом и содержания транскрипционного фактора Apaf-1) путей апоптоза по сравнению с интактной культурой опухолевых клеток. Завершенность апоптоза оценивали, определяя активность каспазы-3 в изучаемых клетках. Выводы. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что процесс убиквитинилирования белков-регуляторов и белков-эффекторов программированной гибели является одним из молекулярных механизмов регуляции апоптоза опухолевых клеток линии Jurkat.

Introduction. One of the crucial tasks in medicine is studying the molecular mechanisms of selective management of tumor cell apoptosis following conformational changes in protein molecules (ubiquitination). The purpose of the study. The aim of the project is to establish the role of ubiquitin and ubiquitinligase in dexamethasone-induced apoptosis in Jurkat cells. Materials and methods. The study was carried out on the Jurkat tumor cell line (intact cells and cells cultured in the presence of an apoptosis inducer dexamethasone in the final concentration of 10 µmol. In intact and dexamethasone-affected Jurkat cells, implementation of apoptosis and the amount of FAS-, TNF Receptor 1 and cells with reduced mitochondrial membrane potential were assessed by flow cytometry using FITC-conjugated Annexin V and Propidium Iodide. The levels of NF-κB, Apaf-1, ubiquitin and ubiquitin ligase were determined by Western blot analysis. The activity of caspase-3 was measured by spectrofluorometry. Results. When adding the apoptosis inducer dexamethasone to the Jurkat cell culture, we registered a fall in the concentration of ubiquitin and a rise in the level of ubiquitinligase against the backdrop of activated receptor- (an increase in the amount of Annexin V positive cells, FAS- and TNF Receptor 1) and mitochondrialmediated (an increase in the number of cells with reduced mitochondrial membrane potential and elevation of Apaf-1 level) pathways of apoptosis, as opposed to the intact cell culture. We estimated the completion of apoptosis by determining the activity of caspase-3 in the investigated tumor cells. Conclusion. The obtained findings allow the conclusion that ubiquitination of regulatory and effector proteins in programmed cell death is one of the molecular mechanisms that regulates and selectively controls apoptosis in Jurkat cells.